引 言

　　流式細胞術（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）也稱為熒光激活細胞分類術（Fluorescence Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS） ，是利用流式細胞儀對處在快速、直線、流動狀態(tài)中的單細胞或者生物顆粒進行多參數(shù)、快速定量分析，同時對特定群體加以分選的現(xiàn)代細胞分析技術。流式細胞儀（Flow Cytometer）是集激光技術、光電檢測技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術以及計算機技術于一體的新型高科技儀器。它能夠高效檢測細胞大小、粒度、表面積等細胞結構參數(shù)和細胞表面 / 胞質 / 核的特異性抗原、細胞內細胞因子、酶活性、Ca2+、細胞活性等細胞功能參數(shù)， 同時還具有細胞分選和計數(shù)能力。自上世紀70年代第一臺流式細胞儀問世以來，歷經 40 多年的迅猛發(fā)展，目前流式細胞儀已經廣泛應用于生物學、藥理學、免疫學、血液學、腫瘤學以及細胞凋亡檢測和臨床檢驗等領域。

　　1  流式細胞儀的結構

　　流式細胞儀主要由液流系統(tǒng)、光學系統(tǒng)、電子系統(tǒng)和細胞分選系統(tǒng) 4 部分組成。經過特定熒光染色的待測樣本細胞懸液，在鞘流的包圍約束下，細胞成單列排布，由流動室噴嘴高速噴出，形成細胞液柱。液柱與激光束垂直相交，相交位置即為檢測區(qū)，在入射激光照射下產生熒光信號和前向散射光信號（FSC，F(xiàn)orward Scatter）與90°側向散射光信號（SSC，Side Scatter） ，可被電子系統(tǒng)檢測并輸入到計算機利用專業(yè)軟件進行細胞多參數(shù)分析與分選。

　　1.1  液流系統(tǒng)

　　液流系統(tǒng)主要負責將待測樣品從樣品室運送到流動室的測量區(qū)域，其理想狀態(tài)是把細胞傳送到激光束的中心，并且在一次曝光時間內，只允許一個細胞通過激光束，然后根據(jù)需要，液流流入廢液桶或者分選收集管。液流系統(tǒng)主要由流動室和液流驅動系統(tǒng)構成。流動室內充滿鞘液，根據(jù)層流原理，在鞘液的包圍下，細胞排成單列從流動室的噴嘴流出，并且被鞘液包圍形成細胞液柱。另外，同軸流動的設計，使得樣品流（核流）和鞘流始終保持分層鞘流的狀態(tài)。

　　1.2  光學系統(tǒng)

　　光學系統(tǒng)負責產生并采集熒光、散射光信號，主要由包括激光、光纖、光束形成棱鏡、聚焦鏡的光學激發(fā)系統(tǒng)和包括熒光物鏡、光纖、光學濾片、檢測器的光學采集系統(tǒng)組成。目前流式細胞儀廣泛使用的是 488nm 的氬離子激光器和 635nm 的氦 - 氖激光器。光學濾光片放置在光電倍增管前面，對去除干擾信號、提高結果的準確性至關重要。

　　1.3  電子系統(tǒng)

　　電子系統(tǒng)的功能是將熒光和散射光信號轉換成電信號， 并進行數(shù)字化處理后送入計算機用專用軟件進行分析，包括光電轉化器、信號放大器、信號處理系統(tǒng)和計算機軟件分析系統(tǒng)。液柱中的細胞經過測量區(qū)域被激光照射，產生熒光信號和前向角散射與 90°側向角散射信號。其中熒光信號由光電倍增管檢測，2 個散射光信號由光電二極管檢測。熒光信號與產生熒光的化學物質有關，前向散射光信號與細胞大小有關，90°側向散射光信號與細胞粒度有關。通過安裝多個濾光片和不同波長的激光器就能得到更多的熒光信號和散射光信號，這對于人們認識細胞內化學物質的相互作用具有十分重要的現(xiàn)實意義。

　　1.4  分選系統(tǒng)

　　利用流動室噴嘴上的高頻壓電晶體的振動，將液流變成只包含單個靶細胞的小液滴，系統(tǒng)根據(jù)鞘流的流速與晶體振動的頻率，精確算出小液滴的間距，然后對其施加相應的電壓，當小液滴通過正負極板時就會發(fā)生偏轉，流入相應的收集管里， 不帶電的液滴就會流入中間的廢液桶里，從而實現(xiàn)對細胞（ 包括中性粒細胞 ） 的分選 　　。

　　2  流式細胞儀的最新進展

　　2.1  光學系統(tǒng)的完善

　　隨著激光技術的發(fā)展，激光器的性能更加優(yōu)異，價格也更加低廉，這使得激光逐漸取代非相干光源，在流式細胞儀中得以廣泛應用。目前，除德國的Partec 等公司的部分產品仍使用汞燈作為光源激發(fā)紫外的熒光物質外，多數(shù)的流式細胞儀都配備多個激光器，同時發(fā)出不同波長的激光以激發(fā)出多種熒光。例如BD 公司的 FACSAria 流式細胞分選儀除配備較為常用的488nm藍光和640nm紅光外，還配備 407nm 光源。同時，染料激光器的出現(xiàn)，使得光源發(fā)出連續(xù)可調的光譜成為可能，極大地擴展波長范圍，可以滿足用戶多種特殊的需求。另外，通過配備多個光學濾光片，可同時檢測多種熒光信號和包括 FSC 和 SSC 在內的信號，豐富人們的視野，更好地實現(xiàn)對細胞的檢測。

　　2.2  靈敏度和分辨率的提高

　　靈敏度反映儀器能夠檢測到最弱的熒光和散射光信號，直接決定能否檢測出待檢測指標。靈敏度主要與待檢測物體被激光照射效率和熒光接收效率有關，靈敏度的高低也是衡量流式細胞儀性能的最重要指標之一 ［4］。通過使用更加貼近最大吸收波長的激發(fā)光源和改善光路系統(tǒng)設計能夠有效提高流式細胞儀靈敏度，同時，使用較高靈敏度的光電檢測元件也可以分析微弱的熒光信號，較大程度上提高流式細胞儀靈敏度。目前流式細胞儀多使用石英微流動室 和數(shù)值孔徑較大的物鏡，使得收集到的細胞熒光信號顯著增強。另外，通過使用光子計數(shù)系統(tǒng)，也能夠實現(xiàn)對一些微弱熒光信號的檢測。光子計數(shù)系統(tǒng)具有較高靈敏度，但是檢測面積比較小，使用時應該用高質量的透鏡組將光子匯聚到它的有效面積上。隨著熒光技術的發(fā)展，市場上出現(xiàn)更多類型的熒光染料可供選擇，熒光的激發(fā)光強也有很大的提高， 實現(xiàn)靈敏度提高。另外， 使用高透射率、高折射率的光纖，也能夠更好地與光源、光電檢測器和芯片耦合，顯著降低光強損失，提高儀器靈敏度。

　　隨著液流系統(tǒng)、光電檢測技術和計算機技術的發(fā)展，流式細胞儀的分辨率也有顯著提高。目前市場上流式細胞儀的分辨率可以達到 1 ∶ 512000，能夠得到 CV 值（變異系數(shù)）很小的實驗數(shù)據(jù)， 徹底改變以往很難把染色體區(qū)分開的局面，這使得分辨率較高的染色體的分析和分選成為可能。同時，隨著靈敏度和分辨率的提高，實驗所需的樣品容量也進一步減少，如 C6 流式細胞儀最小的樣品大小僅為 30µL，這對于難以獲得較大樣品量的研究實驗具有十分重要的意義。

　　2.3  分析和分選速度的提高

　　流式細胞儀非常重要的一個特點就是它能夠實現(xiàn)高速的細胞定量分析和目標細胞的分選。隨著液流控制系統(tǒng)性能的改進和光電檢測元件響應速度和計算機軟件系統(tǒng)的不斷發(fā)展進步， 流式細胞儀的分析和分選速度都有質的提高。目前，BD 公司出品的 FACSAria 流式細胞分選儀獲取速度可達 70000 個細胞 /s，分析速度可達 50000 個細胞 /s。這對于要通過對大量細胞的分析，建立不同細胞類型的數(shù)據(jù)庫具有十分重要的現(xiàn)實意義，如根據(jù)細胞形態(tài)變化和內部結構的變化對腫瘤細胞進行分類等。

　　2.4  實現(xiàn)多色分析

　　流式細胞儀另一個非常重要的特點就是它能夠實現(xiàn)對細胞的多參數(shù)測量。通過使用多種熒光標記物對細胞進行標記，測量激光激發(fā)多色熒光信號，實現(xiàn)單次實驗對細胞多種成分測量。然而，實際中熒光標記物的發(fā)射光譜多較寬，不同的標記物標記細胞后，光電檢測器檢測到的熒光信號往往有重疊的現(xiàn)象，這就需要對熒光信號進行補償。目前 BD 公司研發(fā)的細胞多色分析技術居于領先地位，它采用多根激光束同時激發(fā)流動室中的一個細胞，激發(fā)出來的熒光信號分別經過系統(tǒng)中的多個光學濾光片，被不同的光電檢測器檢測，這樣就可以解決熒光信號重疊的問題，使多色分析達到最佳效果。BD 產品最多可進行15 色熒光分析和前向、側向散射光分析，這樣單次實驗就可以同時獲得多達17個參數(shù)，提供豐富的細胞信息。

　　2.5  儀器小型化 

　　低功耗、小型化、便攜式的細胞分析分選儀器，一直都是各大廠商和科研院所的研究方向。隨著激光光源、光電檢測器件、電子計算機等相關領域的發(fā)展，器件的性能更加優(yōu)越，體積也更小，這使得流式細胞儀的小型化取得很大進展。目前市場上的 C6 流式細胞儀的體積比小型微波爐還要小，重量不足 14kg，功耗也不超過 70W，是真正意義上的小型化分析儀器。

　　以 MEMS 技術（微機電系統(tǒng)）為基礎的微流控芯片（microfluidic chip） 技術具有體積小、效率高、集成度高、速度快等特點，為生化分析領域開辟新的研究方向。國外課題組在這方面已經做很多研究。Hirono 等人采用LED 作光源的微芯片流式細胞成像分析系統(tǒng)實現(xiàn)對血小板凝集數(shù)量的計數(shù)。Wolff 課題組研制一種微芯片細胞分選器，他們將激光光源、檢測器件和細胞的培養(yǎng)室統(tǒng)統(tǒng)集成到一個微型芯片上。該細胞分選器具有尺寸小、分選效率高、價格低等特點，同時采用封閉體系可以有效防止污染，滿足環(huán)保要求。國內方面也有很多課題組從事這方面研究。姚波等人采用靜電力的方法實現(xiàn)對細胞的篩選。當細胞經過檢測區(qū)后，在芯片出樣管道的分支處被施加不同電壓，帶電荷細胞進入出樣管道后，在靜電場力作用下，發(fā)生不同方向的偏轉，進入到相應的收集管里，同時， 為有效消除電滲流影響， 他們還對管壁做涂層處理。

　　2.6  儀器自動化

　　以往流式細胞儀的使用都比較繁瑣，使用起來有相當?shù)碾y度。隨著計算機技術、自動控制技術發(fā)展，目前流式細胞儀在進樣、液流控制、多色熒光分析、細胞分選和數(shù)據(jù)處理等方面都已經實現(xiàn)自動化。例如 BD 公司的FACSAria 細胞分選儀配備液流自動控制系統(tǒng)和軟件自動清洗程序，實現(xiàn)進樣倉自動加壓、自動混勻樣本、自動沖洗進樣管路、液滴監(jiān)控、自動檢查堵塞。系統(tǒng)軟件的分選設定和檢測功能大大簡化操作， 實現(xiàn)細胞分選的無人操作。

　　3  流式細胞儀的應用

　　隨著各種新型的熒光染料和單克隆抗體技術的發(fā)展應用，流式細胞儀在生物學和醫(yī)學領域的應用范圍得到進一步的擴展。目前，基本上能進行熒光分子標記的細胞或者亞細胞微粒都能被流式細胞儀檢測，下面簡要介紹流式細胞儀在細胞生物學、免疫學、腫瘤學等部分領域的應用。

　　3.1  在細胞生物學的應用

　　細胞內 DNA 的含量在整個細胞周期內隨時都發(fā)生周期性的變化，通過熒光探針對細胞內 DNA 含量進行測量，能夠有效分析各個時相的細胞百分比以及 DNA 異倍體。相對于傳統(tǒng)染色體核型分析，流式細胞儀不僅能夠實現(xiàn)染色體分析還能進行純化，以獲得克隆實驗所需的染色體。同時， 流式細胞儀因其具有高效分析和分選能力，在分子遺傳學中也有大量應用，主要是用于研究分離的染色體，以及對特定的染色體進行分選。流式細胞儀在微生物領域的應用相對較晚，但它快速、多參數(shù)測量的特點十分適合解決微生物學面臨的一些問題。目前，在工業(yè)上流式細胞儀能夠用于微生物的快速鑒定，例如對自來水中的微生物學鑒定和控制、對生乳中細菌總數(shù)的檢測等。

　　3.2  在腫瘤學中的應用

　　流式細胞儀在臨床醫(yī)學中最早應用于腫瘤學，主要是通過 DNA 含量和線粒體數(shù)量檢測進行癌前病變和早期癌癥的診斷以及化療指導和愈后評估等。流式細胞儀能夠精確檢測細胞內 DNA 含量，可對癌癥的性質和發(fā)展趨勢進行判斷，利于早期診斷。實際應用中需要將實體瘤組織解聚、分散制成單細胞懸液，并用熒光染料（碘化吡啶PI）染色，對細胞內的 DNA 含量進行檢測。同時需要將不易區(qū)分的群體細胞分成 G1 期、S 期和 G2 期 3 個細胞亞群，DNA 的含量直接代表細胞的倍體狀態(tài)，腫瘤的惡性程度和非倍體細胞有密切關系。流式細胞儀還可對惡性腫瘤 DNA 倍體異質體進行檢測，對患者臨床分期、病理分級、腫瘤轉移具有重要意義。腫瘤早期診斷的一個重要依據(jù)就是 DNA 非整倍體細胞峰的存在。同時，細胞的 DNA 倍體分析也能夠用于病人愈后情況的早期判斷。異倍體腫瘤惡變的復發(fā)率和死亡率都比較高，然而，二倍體和近二倍體腫瘤的愈后狀況明顯比較好。流式細胞儀除能對癌癥 DNA 含量進行分析外，還能夠根據(jù)癌癥 DNA 的分布直方圖變化情況對化療效果進行評估，這對于癌癥的化療具有重要的指導意義。

　　3.3  在免疫學中的應用

　　隨著單克隆抗體技術、熒光色素技術的發(fā)展，流式細胞儀以其快速、定量測量的特點，被廣泛應用于免疫理論研究和臨床實踐當中。通過與熒光抗原抗體結合，對細胞表面和細胞內部的抗原、癌細胞基因蛋白定量分析，實現(xiàn)細胞分類和亞群分析，這對于各種血液病、癌癥、B細胞淋巴瘤的早期診斷和治療以及對人體細胞免疫功能的評估都具有十分重要的現(xiàn)實意義。通過對患者淋巴細胞各個亞群數(shù)量的檢測可以了解淋巴細胞的分化功能，同時，通過對疾病的特異性淋巴細胞亞群或者細胞表面標記物的存在、缺失和過度表達等的研究，可以對一些免疫性疾病、 感染性疾病和腫瘤等進行早期診斷和治療。 此外，還可以利用流式細胞儀進行組織相容性抗原群體分析和器官移植和移植后免疫狀態(tài)監(jiān)測。

　　3.4 在血液學中的應用

　　臨床中通過對外周血 T 淋巴細胞 、骨髓細胞表面抗原和細胞內DNA 含量的檢測，可以對包括白血病、淋巴瘤等多種血液病進行早期診斷、及時治療和愈后情況的判斷。由于各類血細胞都具有特異的抗原，流式細胞儀通過采用特異的抗血細胞表面分化抗原的單克隆抗體，結合熒光染料，就可以測定某個細胞的多項參數(shù)，準確地判斷細胞屬性。流式細胞儀能夠在患者恢復期檢測體內是否還有殘留的病變細胞，這對于及早發(fā)現(xiàn)并采取有效措施防止白血病等疾病的復發(fā)具有極其重要的現(xiàn)實意義。上述應用只是流式細胞儀廣泛應用的一個縮影，流式細胞儀在細胞凋亡檢測、器官移植、精子性別控制、臨床細菌學、植物學等諸多領域都有十分廣泛的應用。可以預見，隨著激光、探測器、計算機技術等相關技術的發(fā)展，流式細胞儀也將會有更加廣泛的應用前景。